产品货号：
HR8279
中文名称：
活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/EthD-I双荧光染料)
英文名称：
Live/Dead Cell Calcein-AM/EthD-I Dual-Fluorescent Staining Kit
产品规格：
500T|1000T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
简要说明：
工作原理：
产品组成：
保存：-20℃，避光，有效期1年。
保存事项：
检测方法：
流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦
适用样品：
悬浮细胞、贴壁细胞
用户自备：
注意事项：
使用方法：
结果分析：
常见问题：
相关搜索：活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/EthD-I双荧光染料)，活细胞染色，死细胞染色
本试剂盒是百奥莱博公司基于Calcein-AM/EthD-I双染料法细胞染色技术开发的，专门用于活细胞和死细胞双重荧光染色的试剂盒。
工作原理：
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。
作为核染色染料的EthD-I （Ethidium Homodimer 1）不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488nm，528nm，发射：617nm)，因此EthD-I仅对死细胞染色。
由于Calcein-DNA和EthD-I-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein,AM和EthD-I经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。
产品组成：
| 组分 | 500T | 1000T | 保存 |
| 染色液Calcein AM | 100μL | 200μL | -20℃避光 |
| 染色液EthD-I | 200μL | 400μL | 2～8℃ |
| 染料稀释液 | 10mL | 20mL |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
保存事项：
- 长期不用可以-20℃保存。
- 染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。
- 染色液Calcein AM为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
- 注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
- 染色液EthD-I溶解后需要用吸头吹打混匀。
- 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。
检测方法：
流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦
适用样品：
悬浮细胞、贴壁细胞
用户自备：
- 仪器准备：流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦、离心机、移液器、冰箱、冰盒。
- 试剂准备：10×PBS缓冲液(pH7.4，10mM)或HBSS(含钙镁葡萄糖，不含酚红)。
- 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套。
注意事项：
- 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
- 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
- 染色液Calcein AM为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
- 染色液Calcein AM为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
- 由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
- Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
- 染色液Calcein AM母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
- 以下实验步骤仅供参考，以实际的样本和文献参考步骤进行调整。可以染色悬浮培养细胞、贴壁细胞、制备的细胞爬片、涂片等原位染色。
使用方法：
- 染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液将染色液Calcein AM和染色液EthD-I分别10倍稀释。
每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μL稀释过的染色液Calcein AM，充分混匀，即成Calcein AM染色工作液。
每10mL HBSS缓冲液或无血清培养基中加入20～200μL稀释过的染色液EthD-I，充分混匀，即成EthD-I染色工作液。- 由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和EthD-I的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
- Calcein-AM染色时间一般15～30分钟，EthD-I染色时间一般1～5分钟。
- 一般细胞Calcein-AM染色时终浓度为试剂盒中母液的1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至500倍稀释或者延长染色时间。EthD-I的使用终浓度为试剂盒中母液的1000～8000倍稀释，常用2000～5000倍。
- Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。
- 注意EthD-I的浓度在染上色的前提下尽可能低，否者可能有细胞毒性，使原本的活细胞染上色。
- 可以不用本试剂盒的染料稀释液，直接用HBSS、无血清培养基配染色工作液。不可以用含血清培养基配制。
- Calcein-AM染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
- 由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和EthD-I的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
- 收集样本细胞。根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时，可以先用胰酶-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。也可以直接原位染色检测。
- 用PBS洗涤细胞两次。
- 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。
- 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。
- 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直到完全洗净。
- 用200μL Calcein AM染色工作液将细胞重悬。
- Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。
- 有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein AM内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM内加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。
- 含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可长期保存，现配现用。
- Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。
- 在室温或37℃避光孵育15～20分钟。
- 分开染色，Calcein AM染色15～30分钟，EthD-I染色1～5分钟即可。
- 同时染色时，一定要注意EthD-I浓度，防止染色活细胞。
- 如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（probenecid，1～2.5mM）或者苯磺唑酮（sulfinpyrazone，0.1～0.25mM）到孵育体系内以降低染料Calcein泄露到胞外。
- 分开染色，Calcein AM染色15～30分钟，EthD-I染色1～5分钟即可。
- 用PBS洗涤细胞。如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。
- 用200μL染EthD-I染色工作液将细胞重悬。
- 在室温或37℃避光孵育2～5分钟。
- 用PBS洗涤细胞。
- 用适量PBS重悬细胞。
- 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为490nm，最大发射波长为515nm和617nm。在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。
结果分析：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。用528nm波长激发，能够看到红色的死细胞。
常见问题：
- 所有细胞都染上红色？
EthD-I浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化EthD-I的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。 - 细胞被同时染上绿色和红色？
样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有Calcein着色并呈碎片状，而且EthD-I也为阳性。
相关搜索：活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/EthD-I双荧光染料)，活细胞染色，死细胞染色